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梅里埃快速病原體檢測解決方案

多重呼吸道病原體檢測

項目建議書

提供精準快速的病原體結(jié)果

流行病數(shù)據(jù)與現(xiàn)狀

呼吸道感染：

呼吸道感染是指病原體感染人體的鼻腔、咽喉、氣管和支氣管等呼吸系統(tǒng)。呼吸道感染通常由病毒、細菌、非典型病原體等引起，治療時必須明確引起感染的病原體以選擇對應(yīng)的治療方案。呼吸道感染是臨床的常見病，其發(fā)病具有著明顯的季節(jié)性：甲型流感在中國北方多出現(xiàn)于每年1-2月，而在中部地區(qū)亦可多出現(xiàn)于6-8月，在南方地區(qū)則多現(xiàn)于每年的4-6月；而乙型流感則多發(fā)于寒冷季節(jié)。

中國各個地區(qū)流感發(fā)病率

表格引自YuH等“CharacterizationofRegionalInfluenzaSeasonalityPatternsinChinaandImplicationsforVaccinationStrategies:Spatio-TemporalModelingofSurveillanceData”

我國主要的流感病原體是甲型流感H1和H3型以及乙型流感。除了甲型流感和乙型流感之外，其他多種病原體也能造成呼吸道感染，比如鼻病毒、腸病毒、冠狀病毒、腺病毒、副流感病毒、偏肺病毒及呼吸道合胞病毒等。急性呼吸道感染的發(fā)生同人體免疫力降低有著直接的關(guān)系，兒童和老年人都是易感人群。一項針對兒童患者的流行病學研究發(fā)現(xiàn)：腸病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、鼻病毒是造成兒童急性上呼吸道感染的主要病原體。

引起兒童急性呼吸道感染的致病體

表格引自顧艷紅等“兒童急性呼吸道感染夏季和冬季病毒病原學分析”

中國兒童普通感冒規(guī)范診治專家共識（2013年）中指出，病毒的病原學地位突出,其中以鼻病毒最常見(30%~50%),其次為冠狀病毒(10%~15%)、呼吸道合胞病毒(5%)、副流感病毒(5%)、腺病毒(<5%)和腸道病毒(<5%)等。對于新生兒和低齡兒童，呼吸道合胞病毒具有非常強的傳染性和致病性，因此對于呼吸道合胞病毒的爆發(fā)和醫(yī)院內(nèi)感染需要特別的重視；另外由于腺病毒造成的呼吸道感染往往病情較重，所以對于腺病毒感染的快速病原體確認也是十分重要的。

一項2015年WHO在12個國家開展的調(diào)查顯示，64%的大眾受調(diào)查者認為抗菌藥物可以用來治療病毒及病毒感染所導致的流感和普通感冒。常識的缺乏，導致了患者和一些醫(yī)生，濫用抗菌藥物。WHO的統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，中國真正需要使用抗生素的病人不到20%,抗生素的不合理使用會引起細菌的耐藥性，耐藥性往往會導致很多嚴重感染治療無效，給患者健康乃至生命造成重大影響.WHO曾發(fā)表全球抗菌素耐藥性報告稱，如果不能迅速采取措施應(yīng)對這一問題，世界將邁向“后抗生素時代”，呼吁各國加強在抗生素耐藥方面的合作。

病原體的明確診斷對于指導有效合理使用抗生素發(fā)揮著至關(guān)重要的作用,這是遏制抗生素耐藥出現(xiàn)的關(guān)鍵.抗擊抗生素耐藥性需要涵蓋全方面的臨床診斷方案:微生物鑒定和藥敏試驗,感染性疾病篩查和主動監(jiān)測,疫情管理和監(jiān)測,細菌以及病毒感染的病原確定和分型.2016中國兒童流感指南中提出，在流感病人出現(xiàn)癥狀的48小時之內(nèi)使用奧司他韋（達菲）可以明顯提高治療成功率、縮短病程。非典型病原體，如社區(qū)性獲得性肺炎（CAP）中的肺炎支原體（M.pneumonia），需要使用阿奇霉素或者紅霉素進行治療，而不是光譜抗生素。只有快速明確病原體及其藥敏結(jié)果,才能夠準確的治療，遏制抗生素耐藥性的發(fā)生,從而有效進行抗生素管理，達到精準治療的目的.

目前呼吸道病原體診斷方法：

目前呼吸道病原體中，細菌通常可以通過傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法解決，大體上需要24~48小時。非典型病原體，如肺炎支原體，肺炎衣原體等通常采用血清抗體檢測，或分子檢測。病毒的檢測則有所不同，傳統(tǒng)的培養(yǎng)，血清學都難以跨越性能和檢測種類的限制。

2015年兒童流感診斷與治療專家共識中提出，確認流感病例需要以下1項或1項以上實驗室檢測陽性者，可以確診流感：

1， 流感病毒核酸檢測陽性。

2， 流感病毒快速抗原檢測陽性，結(jié)合流行病學史判斷。

3， 流感病毒分離培養(yǎng)陽性。

4， 恢復期較急性期血清抗流感病毒特異性IgG抗體水平呈4倍或4倍以上升高。

可以看出分子檢測（病毒核酸，此處流感病毒為RNA病毒）已經(jīng)被臨床所認可。對于病原體檢測來說，傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法難以解決病毒，結(jié)核桿菌的問題。而免疫學檢測也存在反應(yīng)的“窗口期”。PCR檢測正好提供了無限的可能。理論上，只要樣本有一個病原體存在，PCR就可以檢測到。并且通過PCR技術(shù)可以對病毒進行分型，檢出細菌的耐藥基因。

最近，多重PCR技術(shù)（能在一個樣品中檢測大量目標）的有效使用帶來了全新的檢測概念“SyndromicApproach/癥候群處置“。這種診斷方式從患者的癥狀出發(fā)，設(shè)計病原物檢測的組合，進一步改變了需要一系列單獨實驗來檢測不同病原體的模式，一個樣品、一次檢測就能對某種感染癥狀/癥候群做出基本的診斷。

多重PCR(multiplexPCR)，是在同一PCR反應(yīng)管中同時加上多種病原微生物的特異性引物，進行PCR擴增.可用于同時檢測多種病原體或鑒定出是哪一型病原體感染。多重PCR十分適合針對一個樣本，同時檢測與某種特殊感染性綜合癥（如膿毒病、腦膜炎/腦炎以及尿道、呼吸道或胃腸道感染）最常相關(guān)的一組病原體。

現(xiàn)在的多重PCR大多集中在3~5種靶標的檢測，例如流感病毒（分型或不分型）和RSV（呼吸道合胞病毒）的檢測目前在FDA就已有數(shù)種產(chǎn)品獲批。但這些產(chǎn)品檢測的病原體數(shù)目較少，難以滿足臨床的要求。隨著技術(shù)的發(fā)展，梅里埃公司的Film產(chǎn)品超過10種靶點的產(chǎn)品獲批，能夠通過一次檢測，基本涵蓋呼吸道感染，腹瀉，血流感染，腦膜炎等癥候群相關(guān)的病原體。

多重PCR技術(shù)具有以下特點:

? 高效性

當臨床樣本難以獲得或樣本量有限（例如腦脊液），或當多種不同病原體能導致相同臨床表現(xiàn)且臨床醫(yī)師難以判斷致病菌時（如呼吸道感染），多重PCR具有更高效率。

? 靈敏度和準確性

多重PCR能夠提高病原體的檢出率，并且可以同時檢出多重病原體共感染。Matthew等在2015年Medicine中報道，284名患者中，29.6%的患者存在多種病原體的共感染。

? 經(jīng)濟性

多種病原體在同一反應(yīng)體系中同時檢出，將大大的節(jié)省時間，簡化操作，為臨床提供更多更準確的診斷信息。梅里埃公司的Film產(chǎn)品能夠在一個小時左右時間內(nèi)提供至多20種靶標的結(jié)果。

隨著分子技術(shù)的不斷發(fā)展，在呼吸道病原體檢測中，PCR尤其是多重PCR將有著廣泛的應(yīng)用前景。

梅里埃Film快速病原體檢測解決方案介紹

梅里埃公司和Biofire公司

梅里埃公司創(chuàng)建于1963年，公司依賴自身的科技研究和工業(yè)生產(chǎn)資源，始終致力于開發(fā)作為醫(yī)療和工業(yè)用途的體外診斷產(chǎn)品，是體外診斷領(lǐng)域全球排名前十的生產(chǎn)商。集團不斷設(shè)計、開發(fā)、生產(chǎn)和推廣應(yīng)用在臨床和工業(yè)的系統(tǒng)，同時通過一個又一個成功的并購強大自身。梅里埃的診斷產(chǎn)品主要用于傳染病、心血管病、腫瘤病和食品藥品微生物四個主要領(lǐng)域的診斷。目前集團共有19個生產(chǎn)基地、17個研究中心以及42個辦事處，分布于歐洲、北美洲、亞洲和南美洲。在2014年，梅里埃診斷產(chǎn)品總銷售額為16.98億歐元，公司員工超過9000人。梅里埃公司對中國的衛(wèi)生事業(yè)的發(fā)展有著巨大的推動作用作用。2014年習近平主席在訪問法國期間，特意蒞臨梅里埃集團的研發(fā)中心，表示了中國對于梅里埃家族對中國衛(wèi)生事業(yè)發(fā)展的感謝。

梅里埃公司于2013年斥資4.5億美金收購了美國Biofire公司。Biofire公司是世界知名的分子診斷產(chǎn)品供應(yīng)商，最早進入中國市場的實時熒光定量PCR儀器LightCycler所采用的即是Biofire公司（前身IdahoTechnology）的專利技術(shù)。Biofire公司自建立之后，在原有技術(shù)上精益求精，不斷開發(fā)新的技術(shù)和產(chǎn)品，在2012年推出了具有劃時代意義的多重病原體快速診斷系統(tǒng)Film以及呼吸道感染檢測試劑盒，并獲得了FDA的認證。隨后相繼推出了胃腸道感染檢測、血流感染檢測、埃博拉檢測以及腦膜炎/腦炎檢測試劑盒，用于快速準確鑒定病毒、細菌和寄生蟲等病原體。同時仍在研發(fā)新的儀器和產(chǎn)品，以更好的滿足市場的需求。目前Film系統(tǒng)在世界范圍內(nèi)已經(jīng)取得了成功，截止到2015年上半年，全球裝機量超過1900臺。

Film2.0已于2016年9月成功獲得中國食品藥品監(jiān)督總局（CFDA）注冊證。

Film產(chǎn)品及原理介紹

Film系統(tǒng)是基于多重巢式PCR技術(shù)的快速病原體分子診斷產(chǎn)品，可以在1小時內(nèi)完成超過20種病原體的快速檢測。一套完整的Film檢測系統(tǒng)由儀器、配套試劑和軟件組成。

Film儀器：Film儀器體積小巧，雖然只有普通PCR儀器一般的大?。?5.4x39.3x16.5cm），但是卻能夠完成更多的實驗功能：從標本直接進行核酸提取、純化、巢式PCR以及高分辨率熔解曲線結(jié)果判讀?？梢哉f，F(xiàn)ilm一臺儀器完成了過去劃分成三個區(qū)域的標準分子生物學實驗室的所有工作，而且整個過程都是自動化完成，真正實現(xiàn)了“標本進、結(jié)果出”的檢測模式。最值得稱道的是，所有的實驗步驟在儀器內(nèi)只需要65分鐘時間就可以完成；同傳統(tǒng)的核酸提取加上PCR、實時定量PCR、雜交或其他方法相比，大大提高了實驗效率，從繁雜的實驗中解放了實驗室的工作人員。與此同時，這套全封閉的Film儀器，對于工作人員的操作安全提供了最大程度的保證。最新版本的Film2.0系統(tǒng)可以通過一臺電腦同時連接8臺儀器，在減少單個標本檢測時間的同時提高檢測通量。

Film試劑：Film系統(tǒng)獨特設(shè)計的另一個體現(xiàn)就是采用了微流控技術(shù)高度集成化的測試條。如圖中所示，F(xiàn)ilm使用的測試條不同于市面上其他產(chǎn)品，是一種整合了磁珠,反應(yīng)試劑以及反應(yīng)腔的一體化產(chǎn)品；也正是由于這些看上去不那么簡單的設(shè)計，才能夠保證待測標本的核酸提取、純化、擴增、檢測依次精確完成。整體反應(yīng)在密封的環(huán)境中,保證了實驗的生物安全性,并大大降低了結(jié)果污染的可能性；同時干粉狀態(tài)的試劑可以在室溫下長期保存，無須特殊儲存條件。

Film測試條是由塑料薄膜包被的不同反應(yīng)區(qū)域構(gòu)成的，每個反應(yīng)區(qū)域配合測試條自帶的試劑，依次完成核酸提取、純化、擴增、檢測等工作；同時憑借著巧妙地設(shè)計，可以保證反應(yīng)液體在不同區(qū)域之間流動以完成整個實驗。

1） 臨床標本的上樣：將測試條放入樣品加載平臺。來自病人的臨床標本（呼吸道感染檢測為鼻咽拭子標本）經(jīng)過簡單的洗脫之后，從樣本端口被注射入測試條內(nèi)。同時從測試條另一端的緩沖液端口加入溶解緩沖液以溶解測試條內(nèi)干粉狀態(tài)的反應(yīng)試劑。隨后將測試條放入儀器進行測試。整個測試條準備過程十分簡單，只需要２分鐘的時間。

2） 核酸提?。鹤⑷霚y試條的標本，同核酸提取區(qū)內(nèi)的瓷珠混合，在儀器中通過不斷地攪動以破碎細胞，釋放核酸（DNA+RNA）。

3） 核酸純化：上一步中破碎后的樣本進入核酸純化區(qū)域，同可以結(jié)合核酸的磁珠結(jié)合，經(jīng)過洗脫、溶解之后完成核酸純化過程。

4） 反轉(zhuǎn)錄及第一階段PCR：經(jīng)過純化的DNA和RNA進入到第一階段PCR反應(yīng)區(qū)域。首先經(jīng)過一個快速的反轉(zhuǎn)錄過程,將RNA轉(zhuǎn)變成為cDNA，之后開始進行第一階段的多重PCR反應(yīng)。第一階段PCR反應(yīng)涉及到了超過50種引物,擴增較長的DNA片段。

5） 第二階段PCR及熔解曲線檢測，第二階段PCR反應(yīng)發(fā)生在蜂巢形狀的陣列中（共102孔）。而這種測試條的設(shè)計也正是Film系統(tǒng)命名的來源，F(xiàn)ilm（塑料薄膜）+（檢測陣列）=Film!

第一階段PCR的產(chǎn)物在經(jīng)過稀釋后，做為第二階段PCR的模板進入陣列。每個陣列孔之中已經(jīng)預埋了一對引物，用于特異性檢測每個待測靶標。每個PCR體系的體積只有1微升，所以可以保證很高效的完成溫度變化過程，以保證實驗的快速。第二階段PCR體系中除了帶有PCR反應(yīng)必須的引物、模板、dNTP和聚合酶等，還帶有可以結(jié)合在雙鏈DNA上的熒光染料LCGreen。第二階段PCR是巢式PCR，即特異性擴增第一階段擴增得到的待測靶標DNA片段內(nèi)側(cè)的序列。在所有的PCR循環(huán)結(jié)束之后，通過升溫以監(jiān)測各個體系內(nèi)熒光信號水平的變化，從而判讀各PCR產(chǎn)物的熔解溫度。

結(jié)果的判讀：上述獲得的熔解溫度數(shù)據(jù)反饋到Film軟件中，同數(shù)據(jù)庫中的標準熔解溫度進行比對，只有那些出現(xiàn)了熔解峰且熔解溫度正確的測試才會被判讀為陽性結(jié)果。每個靶標的測試都會進行三個重復，體現(xiàn)在檢測陣列的不同位置的三個孔中。只有三個重復測試中2個以上的測試結(jié)果為陽性，最終結(jié)果才會被判讀為陽性。高分辨率熔解溫度的判讀再次提高了結(jié)果的特異性。

不同靶標具有不同的熔解溫度

每個待測靶標在陣列中的不同位置進行3個重復實驗

對照實驗：為了能夠檢測實驗結(jié)果、保證實驗的可靠性，F(xiàn)ilm系統(tǒng)設(shè)計了2個內(nèi)控實驗。第一個內(nèi)控參考品是Schizosaccaromycespombe提取的RNA，從反應(yīng)第一步就同標本一同進入測試條，從頭完成了所有的反應(yīng)過程；如果在最后的檢測中成功檢測到了其正確的熔解曲線峰，則證明全部實驗是可靠的。第二個內(nèi)控品預埋在第二階段PCR的陣列中（已知模板和引物），如果最后能夠檢測到其正確的熔解曲線峰，則證明第二階段PCR反應(yīng)是可靠的。

Film軟件：Film軟件負責控制儀器、分析數(shù)據(jù)、提供測試報告。最新版本的軟件可以同時控制8臺Film2.0版本儀器進行測試?？梢酝ㄟ^條形碼掃描儀輕松的輸入標本信息以及測試條信息，在反應(yīng)結(jié)束之后可以自動打印測試報告。測試報告會列出每個檢測項目的判讀結(jié)果，陰性（Notdetected）或陽性（Detected），從而給出測試的準確診斷。軟件系統(tǒng)可以存儲至多8000條測試信息，同時可以存檔、導入、導出歷史測試報告，進行方便的數(shù)據(jù)庫管理和數(shù)據(jù)溯源。

以呼吸道感染測試為例展示Film測試報告。每個待測靶標的檢測信息都會被列在報告中并標明檢測結(jié)果。

此外相比其他目前在用方法，F(xiàn)ilm系統(tǒng)能夠為您提供以下技術(shù)和使用優(yōu)勢：

1） 使用便捷：只需要2分鐘手工操作，無需單獨的核酸提取，無需配置復雜的PCR反應(yīng)體系。同時為實驗室節(jié)省空間，無需搭建分區(qū)的分子生物學實驗室。

2） 快速報告：測試條在儀器內(nèi)的測試時間不超過65分鐘，也就是可以在一小時左右報告檢測結(jié)果，同現(xiàn)有其他方法相比大大提高了實驗效率。并且可以實現(xiàn)7天24小時的病原學報告，真正滿足臨床急診及重癥監(jiān)護（ICU）對于快速病原學結(jié)果的需求。

3） 避免污染：試劑和儀器都是封閉系統(tǒng)，無需外接水源和試劑，避免了傳統(tǒng)PCR實驗室在核酸提取、擴增過程中可能帶來的操作污染，避免了不必要的醫(yī)療風險。同時也大大提高了實驗室生物安全性。

4） 使用靈活：同一臺電腦可以連接1-8臺Film儀器?？梢詽M足不同通量需求。

5） 體積小巧：Film系統(tǒng)便攜性強，易于組裝、拆卸。對于現(xiàn)有實驗室空間有限的情況，可以靈活進行安排。無需大功率的電源配置，簡單的UPS設(shè)置就可以滿足檢測的續(xù)航需求。

6） 測試廣泛：呼吸道病原體測試條涵蓋廣泛，可以同時檢測包括17種病毒和3種非典型病原體/細菌在內(nèi)的20種病原體?？梢钥焖賹琢鬟M行分型（H1，H1-2009，H3）。此外已經(jīng)獲得針對呼吸道感染、胃腸道感染、腦膜炎/腦炎多種測試的FDA和CE認證,后續(xù)應(yīng)用前景廣泛。

7） 試劑儲存方便：由于所有的反應(yīng)試劑都是以干粉形式保存在測試條中，所以測試條可以常溫保存。十分方便儲存，無需占據(jù)低溫儲存空間。

8） 單靶標成本低：目前使用的分子檢測方法，單靶標的核酸提取和擴增的總成本不低于100元（其他方法，如膠體金，雖然成本較低但是靈敏度、特異性卻差很多），對于20種左右的病原體檢測成本不少于2000元，且操作復雜，耗時長。且能夠滿足更多病原體檢測需求。

FDA臨床數(shù)據(jù)：

呼吸道感染測試的FDA臨床數(shù)據(jù)：

病原體的實驗對照方法為一組/兩組PCR及雙向測序或者直接熒光抗體檢測方法（DFA）

臨床應(yīng)用

提高病原體檢出率：

Film呼吸道感染測試條包含了17種病毒靶點和3種非典型病原體/細菌靶點。相對于傳統(tǒng)的金標快檢，直接免疫熒光（DFA）等檢測方法，可以檢出更多的病原體種類。并且，靈敏的多重巢式PCR(nmPCR)技術(shù)，能夠進一步提高病原體的檢出率，不會有抗體檢測的『窗口期』問題。

Hammond等.-2012-RespiratoryvirusdetectioninimmunocompromisedPatients

快速的周轉(zhuǎn)時間：

對于急診和危重癥患者來說，快速的檢測結(jié)果意味著精準的治療。在2013年西雅圖兒童醫(yī)院的一項研究中，使用Film后，呼吸道病原體的平均報告時間從7小時顯著降低到了1.6小時。這使得大約45%的流感癥狀患者患者(44名)在急診室的過程中就得到了檢測結(jié)果。大約81%(79/96)的流感陽性患者接受了達菲治療（達菲需要在48小時內(nèi)使用效果最佳）。可以看出快速的病原學結(jié)果能夠幫助急診科醫(yī)生對患者進行快速的分流和處置。

Xu等.-2013-Implementationoffilmarrayrespiratoryviralpane

促進抗生素管理：

傳統(tǒng)的經(jīng)驗性診療，難以滿足現(xiàn)有精準醫(yī)療的需求。尤其是現(xiàn)在抗生素耐藥以及多重耐藥菌的問題日益嚴重，使得依賴抗生素的治療更加受到不斷挑戰(zhàn)。快速的病原體診斷，尤其是病毒和非典型病原體檢測方法的不斷進步，使得抗生素管理得到了支撐。Rogers等發(fā)現(xiàn)，在抗生素處方率沒有改變的同時，使用Film后抗生素使用的天數(shù)下降(縮短0.4天（3.2->2.8天）;P<.003).

AngelaR.Branche等，進行了Film和PCT的聯(lián)合研究，在151名干涉組患者中，部分PCT<0.25μg/mL和病毒陽性的患者，抗生素使用時長和用量明顯降低；和歷史數(shù)據(jù)對比(from2008–2011),在非干涉組抗生素使用時長少2天(6.0vs4.0days;P<.001),體現(xiàn)出了研究的效果.由此我們可以看出快速精準的病原學檢測結(jié)果可以更好的滿足臨床現(xiàn)在對于抗生素管理的需求。

完善的售后服務(wù)體系

梅里埃始終秉承“在中國、與中國、為中國”的理念，為中國的公共衛(wèi)生事業(yè)添磚加瓦。

亞太區(qū)總部設(shè)立于上海

位于上海的總部設(shè)立有培訓中心，定期組織各種產(chǎn)品及微生物知識的培訓，面向公司內(nèi)部技術(shù)團隊、經(jīng)銷商技術(shù)團隊及終端用戶。及時有效的將各種產(chǎn)品更新信息及使用信息告知一線使用人員，使產(chǎn)品的服務(wù)更加有效。

專業(yè)的工程師及技術(shù)團隊

整個中國區(qū)擁有一支專業(yè)的儀器安裝維護工程師團隊、資深技術(shù)支持團隊，技術(shù)服務(wù)覆蓋全國。24小時相應(yīng)，72小時現(xiàn)場服務(wù)。

400服務(wù)熱線

熱線人員隨時接聽您的電話，傳遞您的需求給相關(guān)人員。

遍布全國的經(jīng)銷商網(wǎng)絡(luò)

每個區(qū)域都擁有當?shù)氐慕?jīng)銷商及銷售、應(yīng)用、工程師服務(wù)團隊，及時響應(yīng)您的需求，及時到現(xiàn)場為您排憂解難。

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