2023-03-28
2023-03-28
2023-03-27
2023-03-27
民主生活會(huì)批評(píng)他人簡(jiǎn)短語句三篇
2023-03-27
【628568.com--百科大全】
sars病毒論文流感病毒論文：
RNA分子抗SARS病毒的應(yīng)用和研究進(jìn)展
嚴(yán)重急性呼吸綜合征(Severe acute respiratory syn-drome, SARS)又稱傳染性非典型肺炎,是一種嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)傳染病,系由SARS相關(guān)冠狀病毒(Severe acute re-spiratory syndrome associated coronavirus, SARS-CoV)引起的新發(fā)傳染病[1]。SARS-CoV是單股正鏈RNA病毒,呈現(xiàn)典型冠狀病毒基因組結(jié)構(gòu)特征:5′-復(fù)制酶基因-S基因-E基因-M基因-N基因-3′以及5′和3′端非編碼區(qū)[2]。SARS-CoV侵入宿主細(xì)胞后,首先以病毒基因組RNA為模板,翻譯自身RNA依賴的RNA聚合酶,然后利用這種聚合酶完成病毒負(fù)鏈亞基因組RNA轉(zhuǎn)錄、各結(jié)構(gòu)蛋白的mRNA轉(zhuǎn)錄以及病毒基因組RNA復(fù)制等病毒粒增殖過程中的一系列環(huán)節(jié)[3]。目前SARS治療的主要策略有廣譜抗生素、抗病毒劑和免疫調(diào)制療法,但是很少的藥物能夠有效的對(duì)抗病毒[4],因而對(duì)抗SARS治療而言,改進(jìn)治療方案、開發(fā)更加特異性的藥物和更有效的療法十分重要?；诤怂岬幕蛘{(diào)控分子是長(zhǎng)度約20個(gè)堿基的人工合成性單鏈或雙鏈DNA或RNA,這些分子包括核酸配體、反義寡核苷酸、核酶和小干擾性RNA,這些分子以序列特異性方式針對(duì)細(xì)胞或病毒的mRNA,造成靶mRNA斷裂和/或阻斷靶mRNA的轉(zhuǎn)錄與翻譯起始,因此成為基因功能分析和抗病毒藥物開發(fā)的有力工具。本文就這些不同類型RNA分子在抗SARS病毒的應(yīng)用及機(jī)制研究的進(jìn)展進(jìn)行綜述。
1 RNA適配子在抗SARS-CoV中的應(yīng)用
適配子(aptamer)是能與多種目標(biāo)分子以高親和力和高特異結(jié)合的核酸序列,從原始文庫中篩選與配體相對(duì)應(yīng)的適配子的技術(shù)稱為指數(shù)級(jí)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù),即SELEX(Systematic evolution of ligands by exponential enrich-ment)[5-7]。用于抗病毒的適配子是以病毒基因表達(dá)調(diào)控有關(guān)的蛋白酶和關(guān)鍵基因作為主要靶點(diǎn),如SARS-CoV的3CL蛋白酶和NTPase/解旋酶,還有雙鏈RNA/DNA解旋、RNA加帽活性中的關(guān)鍵基因均是理想的抗病毒靶點(diǎn)[8]。目前已經(jīng)利用SELEX技術(shù)從多種文庫中篩選到能夠有效抑制解旋酶活性的適配子。Jang等[9]篩選出針對(duì)SARS-CoV的非結(jié)構(gòu)蛋白nsP10的RNA適配子,可以有效抑制解旋酶的活性。然而,天然RNA在體內(nèi)的穩(wěn)定性差,極易被體內(nèi)各種RNA核酸酶降解,故難以在體內(nèi)應(yīng)用。Shum等[10]篩選到G-四倍體和非G-四倍體兩種構(gòu)象的適配子。但是僅非G-四倍體能夠特異性地抑制病毒解旋酶活性,而G-四倍體卻不能。原因在于非G-四倍體經(jīng)生物素或反向胸腺嘧啶修飾后在血清中的穩(wěn)定性增強(qiáng),這種結(jié)構(gòu)性選擇及對(duì)穩(wěn)定性的修飾作用為尋找解旋酶適配子提供了新線索。適配子具有靶分子范圍廣、親和力和特異性高、穩(wěn)定性好、制備方便等優(yōu)點(diǎn)。隨著對(duì)SARS-CoV感染復(fù)制機(jī)制的深入研究以及核酸適配體技術(shù)的發(fā)展,一些有效且低毒的適配體分子被篩選出來,為抗SARS治療帶來了希望,但是核酸適配子易被體內(nèi)的核酸酶降解,因此它的修飾,轉(zhuǎn)移進(jìn)細(xì)胞等方面也需要進(jìn)一步研究。
2 反義RNA在抗SARS-CoV中的應(yīng)用
反義寡核苷酸(Antisense oligonucleotide, ASON)指能夠以堿基配對(duì)方式與特定DNA和RNA結(jié)合并阻止它們轉(zhuǎn)錄和翻譯的短核酸片段(反義鏈片段)。反義RNA與mR-NA的特異性互補(bǔ)結(jié)合可以抑制后者的翻譯。最早于大腸桿菌的產(chǎn)腸桿菌素的Col E1質(zhì)粒中發(fā)現(xiàn)通過反義RNA控制mRNA翻譯,后來許多實(shí)驗(yàn)證明在真核生物中也存在反義RNA[11]。就反義RNA抗病毒方面的研究而言,早在1978年就有報(bào)道表明反義寡核苷酸可以抑制勞氏肉瘤病毒的復(fù)制[12]。
利用反義RNA能與特定的RNA病毒作用,直接抑制這些病毒的復(fù)制,從而阻斷RNA病毒的繁殖,達(dá)到抗病毒性疾病的目的。ASON在抑制SARS-CoV蛋白表達(dá)的實(shí)際應(yīng)用中,主要通過化學(xué)修飾法來提高ASON的穩(wěn)定性,體外試驗(yàn)證明硫代修飾的ASON能夠下調(diào)SARS-CoV結(jié)構(gòu)蛋白E、M、N的表達(dá)量[13]。而3′端修飾的ASON能夠抑制SARS-CoV突起蛋白(Spike Protein, SP)的mRNA的表達(dá)水平[14]。在抗病毒劑中廣泛研究的肽綴合反義嗎啉代寡聚體(Peptide-conjugated antisense morpholino oligomers, P-PMO)具有更強(qiáng)的反義作用,針對(duì)SARS-CoV 5′UTR中轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列合成的P-PMO可以減少病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞病理學(xué)并減慢病毒在細(xì)胞間的擴(kuò)散[15]。利用與SARS-CoV種系關(guān)系很近的鼠科肝炎病毒(MHV)在體內(nèi)建立感染模型,顯示與MHV病毒基因組RNA5′端配對(duì)的P-PMO可以減少病毒復(fù)制和小鼠組織損傷,但是這種P-PMO也具有潛在毒性[16]。Krahling等用磷酰二胺嗎啉修飾的PPMO可以抑制細(xì)胞凋亡[17]。而感染細(xì)胞的抗凋亡水平的升高能夠減少細(xì)胞的自殺現(xiàn)象[18]。反義核酸技術(shù)原理簡(jiǎn)單、前景誘人,在基礎(chǔ)研究及抗病毒的研究中都顯示出很大的優(yōu)勢(shì)和潛力,在抗SARS的治療中也有潛在的應(yīng)用價(jià)值,但在實(shí)際使用中還存在一些不容忽視的問題,如許多ASONs缺乏特異性且具有免疫刺激性和激活補(bǔ)體的毒副作用,這些都需要我們尋找更有效的途徑來改造和更新原有的思路,才能使它作為分子藥物不斷深入的研究。
3 核酶在抗SARS-CoV中的應(yīng)用
核酶是一類本身具有酶剪切活性的RNA,能夠以序列特異性方式催化靶RNA的切割。迄今發(fā)現(xiàn)的核酶從結(jié)構(gòu)上主要分為兩大類:錘頭型核酶和發(fā)夾型核酶。核酶與反義RNA不同,它們具有催化活性,無免疫原性,在應(yīng)用上可能比反義藥物具有更大的潛力,因此越來越廣泛地應(yīng)用于基因研究與治療各領(lǐng)域。體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明了核酶可以抑制HIV、HBV、HCV病毒的復(fù)制,近幾年也逐漸開始了動(dòng)物水平的評(píng)價(jià),已經(jīng)批準(zhǔn)核酶在抗HIV和癌癥方面進(jìn)行臨床試驗(yàn)[19-21]。Mizutani等報(bào)道了核酶與同源于SARS-CoV的病毒MHV的相互作用,其中與MHV基因組RNA的5′端結(jié)合的核酶能夠抑制MHV增殖[22]。Maeda等合成了與MHV的RNA聚合酶特異結(jié)合的兩種錘頭型核酶:S-核酶和L-核酶,能夠使感染的子代病毒顆粒大量減少,盡管S-核酶剪切RNA的過程比L-核酶慢,但是這兩種核酶的作用效果是相同的[23,24]。然而,如何獲得高效、無毒的特異性核酶,如何選擇靶序列中最佳切割位點(diǎn),如何提高核酶進(jìn)入靶細(xì)胞的效率并穩(wěn)定發(fā)揮作用等問題對(duì)核酶今后的應(yīng)用和發(fā)展提出了新的挑戰(zhàn)。因此,不斷采取新的設(shè)計(jì)策略,提高核酶的切割效率,通過人工篩選或修飾手段構(gòu)建新的人工核酶并擴(kuò)大核酶催化反應(yīng)譜將成為核酶研究的主要內(nèi)容之一。雖然核酶抗SARS-CoV的作用仍在研究中,至今還沒有明確結(jié)果,但是通過研究它對(duì)SARS-CoV種系很近的病毒的作用,可以推測(cè)核酶在抗SARS-CoV基因治療中的潛在效果,為預(yù)防和治療SARS又開拓了一條可行之路,很可能成為未來抗病毒研究的熱點(diǎn)。
4 siRNA在抗SARS-CoV中的應(yīng)用
RNAi(RNA interference, RNAi)最早在研究秀麗新小桿線蟲(C·elegans)反義RNA的過程中發(fā)現(xiàn)[25]。在生物體內(nèi),雙鏈RNA被核糖核酸酶切割成長(zhǎng)度21-23nt的小干擾性RNA(small interfering RNA, siRNA),它能與特定mR-NA結(jié)合引起其降解而導(dǎo)致基因沉默。有關(guān)報(bào)道顯示,siR-NA在細(xì)胞和動(dòng)物水平均可以有效抑制病毒復(fù)制[26,27]。siRNA比ASON具有更強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)和潛力,為研究抗SARS病毒感染過程提供了新的研究工具并且已成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)之一。
眾多研究者確定了針對(duì)SARS-CoV基因組的siRNA作用的不同靶位點(diǎn),并在體外實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中利用這些靶位點(diǎn)通過RNAi方法展示了高效的抗病毒作用。在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中證實(shí)與SARS-CoV的S蛋白特異結(jié)合的siRNA能夠降低S蛋白的表達(dá),并且在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中證明siRNA的作用能夠減輕發(fā)病癥狀[28,29]。目前廣泛應(yīng)用化學(xué)合成和重組質(zhì)粒法產(chǎn)生siRNA。以病毒RNA聚合酶基因?yàn)榘悬c(diǎn)的siR-NA重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞后能夠降低病毒RNA和病毒蛋白的表達(dá)水平,從而抑制病毒復(fù)制[30]。與SARS-CoV的非結(jié)構(gòu)蛋白NSP1序列特異性結(jié)合的質(zhì)粒表達(dá)型siRNA可以使感染后的細(xì)胞病變減輕、活細(xì)胞顯著增加、病毒空斑明顯減少[31]?；瘜W(xué)合成法因其合成效率更高,吸引了更多研究者的關(guān)注。由于對(duì)靶基因不同部位的siRNA具有不同的干擾效率,故需要對(duì)設(shè)計(jì)的siRNA進(jìn)行篩選。Zheng[32]等從化學(xué)合成法產(chǎn)生的48條針對(duì)SARS-CoV基因組中各基因編碼區(qū)的siRNA篩選到4種有效抑制靶基因的分子,并且聯(lián)合應(yīng)用可以顯著提高對(duì)靶基因表達(dá)的抑制效應(yīng)。同樣,Shi等化學(xué)合成針對(duì)SARS-CoV中E、M和N蛋白基因的siRNA能使各個(gè)靶基因的表達(dá)水平降低80%[33]。Wu等合成的針對(duì)SARS-CoV前導(dǎo)序列、TRS、5′-UTR和SP序列的siRNA能夠抑制SARS-CoV復(fù)制[34]。同時(shí),體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了針對(duì)SARS-CoV前導(dǎo)序列的siRNA的抑制強(qiáng)度高于針對(duì)S基因的siRNA和反義寡核苷酸[35],這兩組結(jié)果說明前導(dǎo)序列可以作為有效靶點(diǎn)。盡管眾多研究以病毒基因組中的全長(zhǎng)ORF作為研究SARS-CoV病毒復(fù)制的主要對(duì)象,但是實(shí)驗(yàn)證明亞基因組RNAs(subgeomic RNA,sgRNA)對(duì)病毒的復(fù)制增殖也很重要。以SARS-CoV sgRNA設(shè)計(jì)的siR-NA能夠抑制病毒蛋白的表達(dá),使子代病毒的增殖明顯減少[36]。在RNAi作用過程中,siRNA的穩(wěn)定性和特異性很重要。利用具有高親和力的核苷酸類似物-鎖定核酸(Locked Nucleic Acid, LNA)修飾siRNA后,使其在血清中的穩(wěn)定性大大提高,并且對(duì)靶基因作用效率高于未修飾的siRNA[37]。siRNA逐漸成為抗病毒治療研究領(lǐng)域的熱門工具,為開發(fā)可以預(yù)防和治療SARS的潛在藥物創(chuàng)造了條件。在siRNA的應(yīng)用過程中,怎樣設(shè)計(jì)出有效的siRNA序列,如何有效地將siRNA分子有效的轉(zhuǎn)移到靶器官并進(jìn)入靶細(xì)胞,怎樣提高siRNA的穩(wěn)定性等問題還需解決。但是關(guān)于siRNA的許多研究結(jié)果使大家深信,siRNA是非常有希望被應(yīng)用于臨床的。
5 結(jié) 語
已知新型冠狀病毒SARS-CoV是引起嚴(yán)重急性呼吸道綜合征(SARS)的病原體,目前尚無有效的針對(duì)性預(yù)防和治療藥物。隨著分子生物學(xué)的進(jìn)展,基因治療成為新的抗病毒策略。RNA相關(guān)的抗病毒策略能夠針對(duì)病毒基因組而對(duì)宿主的影響較小,因而在近期的抗SARA治療中得到廣泛關(guān)注,也取得了很大的進(jìn)展。SARS-CoV基因組測(cè)序已經(jīng)完成,對(duì)病毒的分子生物學(xué)特性有了一定了解,針對(duì)病毒復(fù)制、增殖相關(guān)的主要序列為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)的RNA適配分子、反義核酸、核酶、siRNA能夠有效的抑制SARS-CoV的復(fù)制,現(xiàn)在成為醫(yī)學(xué)和生物學(xué)研究的前沿和熱點(diǎn)。本文主要闡述了RNA相關(guān)分子抗病毒機(jī)制取得的一些最新進(jìn)展,國(guó)內(nèi)外的科學(xué)家合成篩選出很多基于RNA的基因調(diào)控分子,體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)均有抗SARS病毒的作用。但是這些相關(guān)技術(shù)仍然需要克服核酸類化合物的固有限制性,如將合成的目的序列導(dǎo)入細(xì)胞的方法、在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性、如何避免脫靶現(xiàn)象和非特異性反應(yīng)以及獲得高療效等。盡管還有很多工作要做,但是這些RNA相關(guān)生物技術(shù)的研究結(jié)果已經(jīng)顯示了誘人的前景,為研究抗SARS病毒藥物提供了可行性,具有廣闊的應(yīng)用前景和臨床實(shí)用價(jià)值。
參考文獻(xiàn):
[1] Marra M A, Jones S J, Astell C R, et al·The genomesequence of the SARS associated coronavirus[J]. Sci-ence, 2003, 300(5624): 1399-1404.
[2] Paul A, Rota M, Steven O, Stephan S, et al. Charac-terization of a Novel Coronavirus Associated with SevereAcute Respiratory Syndrome[J]. Science, 2003, 300(5624): 1394-1399.
[3]芮偉,張其鵬,石磊,等. SARS冠狀病毒RNA聚合酶編碼區(qū)分析.北京大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版) (Rui W, Zhang QP, Shi L, et al. Analysis of coding region in RNA poly-merase of SARS-CoV[J]. Peking Univ (Heal Sci),2003, 35: 137-138.
[4] Stockman L J, Bellamy R, Garner P. SARS: systematicreview of treatment effects[J]. PLoS Med, 2006, 3(9),e343
[5] Tuerk C, Gold L. Systematic evolution of ligands by ex-ponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4DNA polymerase[J]. Science, 1990, 249: 505-510.
[6] Ellington A D, Szostak J W.In vitroselection of RNAmolecules that bind specific ligands[J]. Nature, 1990,346: 818-822.
[7] Jayasena S D. Aptamers: an emerging class of moleculesthat rival antibodies in diagnostics [ J]. Clin Chem,1999, 45: 1628-1650.
[8] Thiel V, Ivanov K A, Putics A, et al. Mechanisms andenzymes involved in SARS coronavirus genome expres-sion[J]. J Gen Virol, 2003, 84(9): 2305-2315.
[9] Jang K J, Lee N R, Yeo W S, et al. Isolation of inhibi-tory RNA aptamers against severe acute respiratory syn-drome (SARS) coronavirus NTPase/Helicase[J]. Bio-chem Biophys Res Commun, 2008, 366(3):738-744.
[10] Shum K T, Tanner J A. Differential inhibitory activi-ties and stabilisation of DNA aptamers against theSARS coronavirus helicase[J]. Chembiochem, 2008, 9(18): 3037-3045.
[11] Tomizawa J, Itoh T, Selzer G, et al. Inhibition ofColE1 RNA primer formation by a plasmid-specifiedsmall RNA[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 1981, 78(3): 1421-1425.
[12] Zamecnik P C, Stephenson M L. Inhibition of Roussarcoma virus replication and cell transformation by aspecific oligodeoxynucleotide[J]. Proc Natl Acad SciUSA, 1978, 75(1): 280-284.
[13] Shi Y, Luo H, Jia J, et al. Antisense downregulationof SARS-CoV gene expression in Vero E6 cells[J]. JGene Med, 2005, 7(1): 97-107
[14] Wang Z, Shi J, Jin H, et al. Properties of isonucleoti-de-incorporated oligodeoxynucleotides and inhibition ofthe expression of spike protein of SARS-CoV[J]. Bio-conjug Chem, 2005, 16(5):1081-1087.
[15] Neuman B W, Stein D A, Kroeker A D, et al. Inhibi-tion, escape, and attenuated growth of severe acute re-spiratory syndrome coronavirus treated with antisensemorpholino oligomers [J]. J Virol, 2005, 79 (15):9665-9676.
[16] Neuman B W, Stein D A, Kroeker A D, et al. Inhibi-tion and escape of SARS-CoV treated with antisensemorpholino oligomers[J]. Adv Exp Med Biol, 2006,581: 567-571.
[17] Krahling V, Stein D A, Spiegel M, et al. Severe acuterespiratory syndrome coronavirus triggers apoptosis viaprotein kinase R but is resistant to its antiviral activity[J]. J Virol, 2009, 83(5): 2298-2309.
[18] Parris G E. Hypothesis links emergence of chloro-quine-resistant malaria and other intracellular patho-gens and suggests a new strategy for treatment of dis-eases caused by intracellular parasites[J]. Med Hypot-heses, 2004, 62(3): 354-357
[19] Alessio P. Prospects for antiviral ribozymes and de-oxyribozymes[J]. Rev. Med, Virol, 2004, 14: 47-64.
[20] Jon E. Chatterton, Hu X Y, et al. Ribozymes in geneidentification, target validation and drug discovery[J].Targets, 2004, 3(1): 10-17.
[21] Khan A U. Ribozyme: A clinical tool[J]. ClinicaChimica Acta, 2006, 367: 20-27.
[22] Mizutani T, Hayashi M, Maeda A, et al. Inhibition ofmouse hepatitis virus multiplication by antisense oligo-nucleotide, antisense RNA, sense RNA and ribozyme[J]. Adv Exp Med Biol, 1993, 342: 129-135.
[23] Maeda A, Mizutani T, Hayashi M, et al. Inhibition ofviral multiplication by hammerhead ribozymes targetedagainst the polymerase gene of mouse hepatitis virus[J]. J Vet Med Sci, 1994, 56(5): 939-945.
[24] Maeda A, Mizutani T, Hayashi M, et al. Inhibition ofviral multiplication in acute and chronic stages of infec-tion by ribozymes targeted against the polymerase geneof mouse hepatitis virus[J]. Adv Exp Med Biol, 1995,380: 399-404.
[25] Wilkins C, Dishongh R, Moore S C, et al. RNA inter-ference is an antiviral defence mechanism in Caenorhab-ditis elegans. Nature, 2005, 436(7053): 1044-1047.
[26] Park W S, Miyano-Kurosaki N, Hayafune M, et al.Prevention of HIV-1 infection in human peripheralblood mononuclear cells by specific RNA interference. NucleicAcids Res, 2002, 30(22): 4830-4835.
[27] McCaffrey A P, Nakai H, Pandey K,et al. Inhibitionof hepatitis B virus in mice by RNA interference. NatBiotechnol, 2003, 21(6): 639-644.
[28] Zhang Y, Li T, Fu L, et al. Silencing SARS-CoVSpike protein expression in cultured cells by RNA in-terference[J]. FEBS Lett. 2004, 560(1-3): 141-146.
[29] Li B J, Tang Q, Cheng D, et al. Using siRNA inprophylactic and therapeutic regimens against SARScoronavirus in Rhesus macaque[J]. Nat Med, 2005,11(9): 944-951.
[30] Wang Z, Ren L, Zhao X, et al. Inhibition of severe a-cute respiratory syndrome virus replication by small in-terfering RNAs in mammalian cells[J]. J Virol, 2004,78(14): 7523-7527.
[31] Ni B, Shi X, Li Y, et al. Inhibition of replication andinfection of severe acute respiratory syndrome-associat-ed coronavirus with plasmid-mediated interferenceRNA[J]. Antivir Ther, 2005, 10(4): 527-533.
[32] Zheng B J, Guan Y, Tang Q, et al. Prophylactic andtherapeutic effects of small interfering RNA targetingSARS-coronavirus[J]. Antivir Ther, 2004, 9(3): 365-374.
[33] Shi Y, Yang D H, Xiong J, et al. Inhibition of genesexpression of SARS coronavirus by synthetic small in-terfering RNAs[J]. Cell Res, 2005, 15(3): 193-200.
[34] Wu C J, Huang H W, Liu C Y, et al. Inhibition ofSARS-CoV replication by siRNA[J]. Antiviral Res,2005, 65(1): 45-48.
[35] Li T, Zhang Y, Fu L, et al. siRNA targeting the lead-er sequence of SARS-CoV inhibits virus replication[J].Gene Ther, 2005, 12(9): 751-761.
[36] Akerstr m S, Mirazimi A, Tan Y J. Inhibition ofSARS-CoV replication cycle by small interferenceRNAs silencing specific SARS proteins, 7a/7b, 3a/3band S[J]. Antiviral Res, 2007, 73(3): 219-227.
[37] Elmén J, Thonberg H, Ljungberg K, et al. Lockednucleic acid (LNA) mediated improvements in siRNAstability and functionality [ J]. Nucleic Acids Res,2005, 33(1): 439-447.